Nickase和CRISPR：革命性的基因編輯工具

什麼是CRISPR？

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是一種基因組編輯(genome editing)的技術，將目標基因剔除後，藉由細菌遺傳物質的修復機制，把被剪斷的基因片段接起來。他可以在細胞內進行編輯，在生物科技及臨床醫學上有廣泛的研究。
 

CRISPR 分為三種類型，從中舉例來說，最簡單有效率的一種是 microbial CRISPR type II 適應性免疫系統的 CRISPR-cas9，成功設計於各種動植物與細菌的基因組編輯應用 ^[1]。

 

CRISPR-cas9 基因編輯新技術

CRISPR-cas9 是透過來自於化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes) 的 Cas9 核酸內切酶蛋白和一個 small-guide RNA (sgRNA)形成一個複合物，複合物會跟互補的 DNA 進行辨識。辨識 DNA 序列最主要的是透過 gRNA 5’端上的 Protospacer 的序列，而每個 protospacer 兩側都有一個短的 protospacer-adjacent motif (PAM)，cas9 複合物辨識 PAM，並誘導目標 DNA 雙鍵斷裂(Double-strand Break, DSB) 促進基因編輯 。雙鍵斷裂可以通過非同源末端連接 (Non-homologous End Joining, NHEJ) 或同源定向修復 (Homology Directed Repair, HDR ) 。NHEJ 容易發生隨機缺失或插入，出錯率高，有很大的編輯限制；HDR 使用同源模板重組，能夠置換序列，雖然精確但是只發生在細胞分裂時期，效率較低[1]。

(圖一) CRISPR-Cas9 的基因編輯機制^[4]。

雖然 sgRNA 通常可以設計成對所需靶位點是具有高特異性的，但有許多證據表明 cas9 有較高可能性的脫靶效應（off-target effects），意思是基因編輯改變了非目標基因，此現象可能會混淆實驗結果並限制 CRISPR-Cas9 系統的實用性。有許多研究各種方法減少此效應，cas9 nickase 為其中之一^[2][3]。

 

NICkase 的生物作用機轉

 CRISPR 依據技術不同有各種切口酶 (Nickase)，以 cas9 舉例，為了減少野生型 cas9 的脫靶作用（off-target effects），Cas9 使原本兩個催化位點其中一個失活，突變轉化成能夠切割單鏈 DNA 的切口酶 (Cas9 nickase)。而 Cas9 Nickase 又可分爲 RuvCD10A 和 HNHN863A，機轉與一般 endonuclease 一樣，差異在野生型的切割是在 RuvC 及 HNH 雙鏈各一個位點上，但 D10A 會使其中一鏈 RuvC 失活，只在 sgRNA 互補鏈上切割；而 N863A 被發現可以使 HNH 失活，在非目標鏈上切割。因為 Cas9 Nickase 只切割一條 DNA 鏈，產生可以確實修復的單鏈斷裂 (Single-strand Break，SSB)，當單鏈切斷時，會藉由 HDR 途徑修復，用完整的互補 DNA 鏈當作模板，脫靶效應會降到最低而不會導致插入缺失 ^[1] 。

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(圖二 a)為野生型 cas9 endonuclease 切割在兩個位點上^[3]。


(圖三)D10A 會使 RuvC 失活，只在 sgRNA 互補鏈上產生缺口；
而 N863A 被發現可以使 HNH 失活，在非目標鏈上產生缺口^[1]。

參考資料

1. Alexandro E Trevino, Feng Zhang . (2014). Genome editing using Cas9 nickases. Methods Enzymology. Vol. 546:161-74. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00008-8.
2. Chiang, TW., le Sage, C., Larrieu, D. et al. (2016). CRISPR-Cas9^D10A nickase-based genotypic and phenotypic screening to enhance genome editing. Scientific Reports .Sci Rep 6,24356. doi.org/10.1038/srep24356.
3. Komor AC, Badran AH, Liu DR. (2017).CRISPR-Based Technologies for the Manipulation      of      Eukaryotic      Genomes.      Cell.      168(1-2):20-36.      doi:
   10.1016/j.cell.2016.10.044.
4. Cribbs, Adam & SMW, Perera. 2017. Science and Bioethics of CRISPR-Cas9 Gene Editing: An Analysis Towards Separating Facts and Fiction. The Yale journal of biology and medicine.90:625-634. PMID: 29259526; PMCID: PMC5733851.