Nickase と CRISPR: 革新的な遺伝子編集ツール

CRISPRとは？

CRISPR(clustered regular interspaced short palindromic repeat)はゲノム編集(ゲノム編集)技術の一種です。 標的遺伝子が削除された後、切断された遺伝子断片は、細菌の遺伝物質の修復メカニズムによって接続されます。 彼は細胞内で編集することができ、バイオテクノロジーと臨床医学に関する広範な研究を行っています。

CRISPR は 3 つのタイプに分けられます。最も単純で効率的なのは微生物の CRISPR タイプ II - 適応免疫システムの CRISPR-cas9 です。 さまざまな動物、植物、細菌のゲノム編集アプリケーション向けに設計されています [1]。
 

CRISPR-cas9 遺伝子編集: 新しいテクノロジー

CRISPR-cas9 は、Streptococcus pyogenes 由来の Cas9 エンドヌクレアーゼタンパク質と small-guide RNA (sgRNA) によって形成され、複合体を形成し、複合体は相補的な DNA を認識します。 DNA 配列の主な認識は、gRNA の 5' 末端にあるプロトスペーサーの配列によって行われ、各プロトスペーサーは両側に短いプロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) を持っています。 cas9 複合体は PAM を認識し、標的 DNA の二重結合切断 (Double-strand Break、DSB) を誘導して遺伝子編集を促進します。 二重結合の切断は、非相同末端結合を介して発生する可能性があります。 (非相同末端結合、NHEJ) または相同性指示修復 (相同性指示修復、HDR)。 NHEJ は、ランダムな削除または挿入が発生しやすく、エラー率が高く、編集上の大きな制限があります。 HDR は、シーケンスを置き換えることができる相同テンプレート組換えを使用しますが、正確ではありますが、効率の低い細胞分裂中にのみ発生します [1]。
 

(図 1) CRISPR-Cas9 の遺伝子編集メカニズム[4]。
 

多くの場合、sgRNA は目的の標的部位に対して高度に特異的に設計できますが、cas9 には高い確率 (オフターゲット効果) があるという多くの証拠があり、遺伝子編集がオフターゲット遺伝子を変更することを意味します。この現象は実験結果を混乱させる可能性があります。 CRISPR-Cas9 システムの有用性を制限します。 この影響を軽減するためのさまざまな方法を調査する多くの研究があり、cas9 ニッカーゼはその 1 つです [2][3]。
 

ニッカーゼの生物学的作用メカニズム

CRISPR には、さまざまな技術に応じてさまざまなニッカーゼがあります。 例として cas9 を取り上げます。 野生型 cas9 のオフターゲット効果を減らすために、Cas9 は元の 2 つの触媒部位の 1 つを不活性化し、Cas9 は元の 2 つの触媒部位の 1 つを不活性化し、変異によってそれを切断できるニッカーゼ (Cas9 ニッカーゼ) に変換します。 一本鎖DNA。 Cas9 Nickase は、RuvCD10A と HNHN863A に分けることができ、メカニズムは一般的なエンドヌクレアーゼと同じですが、違いは、野生型の切断は、RuvC と HNH の二重鎖のそれぞれ 1 つのサイトですが、D10A は 1 つを不活性化します。 相補鎖の sgRNA 切断でのみ、RuvC の鎖。 一方、N863A は、HNH および非標的鎖の切断を不活性化することがわかりました。 Cas9 ニッカーゼは 1 本の DNA 鎖のみを切断するため、修復可能なシングル ストランド ブレーク (SSB) が発生します。 一本鎖が切断されると、完全な相補的 DNA 鎖をテンプレートとして使用して HDR 経路によって修復され、インデルを引き起こすことなくオフターゲット効果が最小限に抑えられます [1]。

(図 2.a) 野生型 cas9 エンドヌクレアーゼは 2 つの部位で切断されます [3]。


(図 3) D10A は RuvC を不活性化し、sgRNA の相互鎖に穴を開けます。
一方、N863A は HNH を不活性化し、非標的鎖に穴を開けることがわかっています [1]。

References
[1] Alexandro E Trevino, Feng Zhang . (2014). Genome editing using Cas9 nickases. Methods Enzymology. Vol. 546:161-74. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00008-8.

[2] Chiang, TW., le Sage, C., Larrieu, D. et al. (2016). CRISPR-Cas9^D10A nickase-based genotypic and phenotypic screening to enhance genome editing. Scientific Reports .Sci Rep 6,24356. doi.org/10.1038/srep24356.

[3] Komor AC, Badran AH, Liu DR. (2017).CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168(1-2):20-36. doi: 10.1016/j.cell.2016.10.044.

[4] Cribbs, Adam & SMW, Perera. 2017. Science and Bioethics of CRISPR-Cas9 Gene Editing: An Analysis Towards Separating Facts and Fiction. The Yale journal of biology and medicine.90:625-634. PMID: 29259526; PMCID: PMC5733851.