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2023.02.04

Nickase 的生物作用機轉與 Buffer 之間的關聯

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Nickase 的生物作用機轉與 Buffer 之間的關聯

文: 黃俊淵 / 聚和國際 R&D 實習生
攝影師：RF._.studio: https://www.pexels.com/zh-tw/photo/3825572/

CRISPRs (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 為一小段 DNA 片段重覆 (repeat)，且具有等長度的間格 (spacer) 序列，是細菌免疫系統一部份，當部分細菌受病毒感染且存活時，可使用 CRISPR 記憶曾經感染的病毒 DNA，識別並於病毒整合 (integration) 入細菌 DNA 前摧毀。此特性被廣泛使用於 DNA 和 RNA 編輯技術中，相較早期使用酵素的基因編輯技術 (ZFNs, TALENs) 而言，CRISPR 顯得極為快速，為近年生科重點關注項目。

CRISPR 技術特性：

CRISPR 技術依據不同的切口酶 (Nickase) 來命名，例如 CRISPR/Cas9 或 CRISPR/Cpf1，目前已發現三個不同類型 CRISPR/Cas 系統，其中 Type II 依賴 Cas9 和 guide RNA 形成複合體來運作 (圖一) [1]。

(圖一) 一個 CRISPR/Cas9 的識別複合體，

由 guide RNA (由 crRNA 和 tracerRNA 或 sgRNA 組成) 和 Cas9 組成^[1]。

首先由guide RNA (crRNA tracerRNA) 的 Protospacer 序列辨識目標 DNA 序列，目標吻合後 Cas9 剪斷目標 DNA 中緊鄰 Protospacer 後的三個胺基酸 (NGG)，稱為 Protospacer adjacent motif (PAM) 的雙股 DNA 序列，此後經由細胞內原有的修復機制進行 DNA 修復 (圖二)。

(圖二) CRISPR 運作流程^[6]

Nickase 種類與其對應的 Buffer 使用：

為控制 RNA 雜交、摺疊、與酶交互作用，透過 RNA 和 NAI-N3 (azide-substituted acylating agent) 產生多醯化 RNA 阻止與互補核酸雜交，此步驟稱為 masking，如要恢復RNA 摺疊與活性，使用 water-soluble phosphine 引發 azide 的 Staudinger reduction，可使醯基自發性的去除[2]，此步驟則是 unmasking，Staudinger reduction 可在 PH 介於 6.9-8.9 範圍間調節 gRNA 的活性[3]，使用的生物緩衝液需滿足適當的溶解度、滲透性、 pKa、不形成複合物、不應與酶發生反應等多項條件方為合適的緩衝液 (未列舉所有條件，詳[4][5])。而不同的 Nickase 種類與操作流程進行，將會使用不同的緩衝液，以 CRISPR/Cas9 為例，gRNA 轉錄純化、masking 步驟使用 HEPES-KOH 和 HEPES 為緩衝液，而後續的 unmasking 和 DNA 切割則使用 Tris-HCl 和 1× NEBufferTM3.1 緩衝液中操作[3]。

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參考資料：

Redman, M. King, A. King, D. et al.. What is CRISPR/Cas9? Arch Dis Child Educ Pract Ed. 2016 Aug; 101(4): 213–215. doi: 10.1136/archdischild-2016-310459.
Kadina, A. Kietrys, A. Eric, T. RNA Cloaking by Reversible Acylation. Angew Chem Int Ed Engl. 2018 Mar; 57(12): 3059-3063. doi: 10.1002/anie.201708696.
Wang, R. Wu, Y. Zhou, X. et al.. Conditional control of RNA-guided nucleic acid cleavage and gene editing. Nature Communications 2020; 11(91). doi: 10.1038/s41467-019-13765-3.
Good, N. E. & Izawa, S. [3] Hydrogen ion buffers. Photosynthesis and Nitrogen Fixation Part B. Methods in Enzymology 1972; 24: 53–68. doi: 10.1016/0076-6879(72)24054-x.
Scopes, R. Verlag, S. Protein purification: Principles and practice, 3rd edition. FEBS Letters 1994 Oct; 352(3): 400-401. doi: 10.1016/0014-5793(94)80041-3.
Zhao, Z. Li, C. Tong, F. Deng, J. huang, G. Sang, Y. Review of applications of CRISPR-Cas9 gene-editing technology in cancer research. Biological Procedures Online 2021; 23(14). doi: 10.1186/s12575-021-00151-x