腺相關病毒 (Adeno-associated viruses, AAV)載體的製備要點
使用病毒作為載體，簡言之為將病毒本身的基因取出後，再於其中植入治療基因， 以此作為治療基因的遞送角色，以修復患者突變或缺陷的基因。 而將病毒本身的基因取出這個步驟，即為病毒純化。 在當前所使用的病毒載體中，以腺相關病毒 (Adeno-associated viruses, AAV)最為常見。
腺相關病毒 (Adeno-associated viruses, AAV)
在臨床研究中，對於基因轉移效率、不致病性，以及長期表達性等各方面皆表現出巨大的潛力，使其成為目前最為理想的基因治療之病毒載體。
延伸閱讀: 基因治療中最常見的四種病毒載體
如何製備腺相關病毒 (Adeno-associated viruses, AAV)載體？
腺相關病毒載體的製備流程為：
- Step1. 質粒開發與生產
- Step2. 細胞擴增，質粒轉染和病毒載體生產
- Step3. 純化
- Step4. 填充
延伸閱讀:The 9 best biological buffers for cell culture
執行完以上步驟便完成了AAV載體的製備。 水能載舟，亦能覆舟。在病毒載體製程中的一絲誤差，都有導致細胞突變、致病的可能。為了讓病毒載體有最佳的治療效果，這個看似簡單的過程實則步步為營，以下為大家統整載體製程中需要注意的事項：
腺相關病毒 (Adeno-associated viruses, AAV)載體的製備要點
質體(Plasmid)設計：
在質體設計、建構和生產過程中需進行純化與檢測，以降低或移除可能的基因污染物，並將基因同源性降到最低。透過改變 rep/cap 的轉錄方向，儘可能減少具複製能力的腺相關病毒產生。
選擇病毒血清型(Serotype)：
不同血清型之腺相關病毒可感染不同組織類型的細胞，目前已知的AAV血清型有AAV1-AAV9共八種，而臨床應用上以AAV2最為常見。
下表為AAV血清型可感染的組織或器官：
- AAV1: 肌肉、心臟、神經組織
- AAV2: 腦、中樞神經、肌肉、肝臟、視網膜
- AAV3: 肌肉、肝臟、肺臟、視網膜
- AAV4: 腦、中樞神經、肌肉、視網膜
- AAV5: 中樞神經、肺臟、眼睛、關節、胰臟
- AAV6: 肺臟、心臟
- AAV7: 肌肉、肝臟
- AAV8: 中樞神經、肌肉、肝臟、視網膜
- AAV9: 中樞神經、肌肉、肝臟、肺臟、心臟
改造病毒殼體 (Virus capsid)：
由於腺相關病毒通常不具致病性，以致患者就算感染也不會有任何徵狀，體內卻已生成該病毒的抗體。因此在使用腺相關病毒作為載體前，需先檢測患者體內是否已存在抗體。亦可透過改造病毒殼體以降低患者體內對原先殼體的免疫原性。
使用輔助病毒 (Helper virus)：
腺相關病毒需透過輔助病毒提供感染及輔助蛋白質的功能，首先利用易受感染之細胞株，轉染兩個輔助質體來製備，再利用腺病毒作為輔助病毒感染，使腺相關病毒基因體可進入裂解程序，進而形成的腺相關病毒顆粒。通常在感染後48至72小時可收集上清液和細胞裂解物純化出病毒載體。注意在製程中需設計使輔助病毒失去活性的步驟。
核酸酶消化 (Nuclease digestion):
細胞裂解會釋放大量宿主細胞的DNA與RNA，以及未包封的病毒DNA，因而增加細胞裂解液的黏度，使進一步的純化步驟變得複雜。故DNA和RNA必須用核酸酶消化以去除不必要的核酸，並避免聚集。
兩性離子界面活性劑 (Zwitterionic surfactants)：
除了核酸酶外，部分的純化方式還會使用到兩性離子界面活性劑。而CHAPS (CAS 75621-03-3)所具備的幾點特性，使其成為純化製程中使用兩性離子界面活性劑的最佳選擇：
- 維持蛋白質活性能力極佳。
- 可在很寬的pH值（pH 2-12）範圍內使用。
- CMC值高（8-10 mM），容易透析去除、不易殘留。
- 對周圍的環境變化不敏感。
- 能溫和的裂解病毒粒子。
- 病毒粒子回收率佳。
延伸閱讀:為什麼要使用CHAPS？
延伸閱讀:What is the critical micelle concentration (CMC)?
延伸閱讀: 病毒載體純化過程適用的生物緩衝劑與生物洗滌劑
基因治療的概念看似簡單，執行起來卻不簡單。面對不同的疾病與基因亦需做出不同的「客製化」設計。在基因治療藥物的研發過程中依然存在諸多需要克服的困難，亦因此造成基因治療藥物背後皆附帶高昂的研發成本。為了造福更多為疾病所苦的人，學者們無不傾盡心力、投入畢生心血，希望能在基因治療達到突破。
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參考資料:
[1] 一种快速高效分离和纯化重组腺病毒相关病毒的方法和用途: https://patents.google.com/patent/CN1139656C/zh
[2] Proton NMR based investigation of the effects of temperature and NaCl on micellar properties of CHAPS: https://www.semanticscholar.org/paper/Proton-NMR-based-investigation-of-the-effects-of-on-Qin-Liu/29678d6ce3b6437498748054e51c4b4a920249af
[3] AAV Purification by Iodixanol Gradient Ultracentrifugation: https://www.addgene.org/protocols/aav-purification-iodixanol-gradient-ultracentrifugation/#:~:text=In%20research%2C%20iodixanol%20is%20used,organelles%2C%20lipoproteins%2C%20and%20macromolecules.&text=The%20iodixanol%20gradient%20in%20this,from%20an%20impure%20AAV%20preparation.
[4] Removal of Endotoxin from rAAV Samples Using a Simple Detergent-Based Protocol : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6804492/
[5] Effective and Accurate Gene Silencing by a Recombinant AAV-Compatible MicroRNA Scaffold: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31843447/
[6] Streamlined large-scale production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11883083/
[7] Proton NMR based investigation of the effects of temperature and NaCl on micellar properties of CHAPS: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21322620/
[8] Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications: https://www.nature.com/articles/s41598-019-49624-w
[9] 藉Recent advances in recombinant adeno-associated virus vector production: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0085253815482031
[10] Downstream Manufacturing of Gene Therapy Vectors: https://downstreamcolumn.com/downstream-manufacturing-gene-therapy-vectors/
