アデノ随伴ウイルス (AAV)

臨床研究では、AAV は遺伝子導入効率の大きな可能性を示しています。 非病原性と長期発現により、遺伝子治療に最も理想的なウイルスベクターになります。

参考文献: The four kinds of viral vectors which most use in gene therapy

アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターの調製方法は？

アデノ随伴ウイルスベクターの調製プロセス：

参考文献:The 9 best biological buffers for cell culture

上記の手順を実行した後、AAV ベクターの準備が完了します。 舟を運ぶ水は、舟を飲み込む水と同じです。 ウイルスベクターの作製過程でのわずかなミスが、細胞の突然変異や病気の原因となることがあります。 ウイルスベクターが最高の修復効果を発揮するためには、この一見単純なプロセスが、実際には段階を踏んで行われます。 以下は、統合されたベクター製造プロセスで知っておく必要があることです。

AAV ベクター作成のポイント

プラスミド設計:

プラスチドの設計、構築、および生産のプロセスでは、可能性のある遺伝的汚染物質を削減または除去し、遺伝子の相同性を最小限に抑えるために、転写の方向を rep/cap を変更することによって、複製可能なアデノ随伴タンパク質の生産を最小限に抑えるために、精製とテストが必要です。 ウイルス。

ウイルスの血清型を選択:

異なる血清型のアデノ随伴ウイルスは、異なる型の細胞に感染する可能性があります。 AAV1 ～ AAV9 は、8 つの既知の AAV 血清型でした。 AAV2 は、その中で臨床応用で最も一般的です。

AAV血清型に感染する可能性のある組織または器官:

変更されたウイルス キャプシド:

通常、アデノ随伴ウイルスは病原性がないため、感染しても無症状ですが、ウイルスに対する抗体が体内で作られています。 アデノ随伴ウイルスをベクターとして使用する前に、患者がすでに抗体を持っているかどうかを調べる必要があり、ウイルスキャプシドを改変することで、患者の体の免疫原性を元のキャプシドに下げることも可能です。

ヘルパー ウイルスを使用します:

アデノ随伴ウイルスは、ヘルパーウイルスを介して感染機能とヘルパータンパク質を提供する必要があります。 まず、感受性細胞株を使用して 2 つのヘルパー プラスチドをトランスフェクトし、それを準備してから、アデノ ウイルスをヘルパー ウイルスとして使用して腺に感染させます。 ウイルスゲノムは溶解プロセスに入り、アデノ随伴ウイルス粒子を形成します。 通常、ウイルスベクターを精製するために、感染後48～72時間で上清と細胞溶解物を回収することができます。 このプロセスは、ヘルパー ウイルスを不活性化するように設計する必要があることに注意してください。

ヌクレアーゼ消化:

細胞溶解は、大量の宿主細胞 DNA および RNA、ならびにカプセル化されていないウイルス DNA を放出し、細胞溶解物の粘度を増加させ、さらなる精製工程を複雑にします。 したがって、不要な核酸を除去して凝集を避けるために、DNA と RNA をヌクレアーゼで消化する必要があります。

双性イオン界面活性剤:

ヌクレアーゼに加えて、一部の精製方法では両性イオン界面活性剤も使用されます。 CHAPS (CAS 75621-03-3) には、精製プロセスでの両性イオン界面活性剤の使用に最適ないくつかの特徴があります。

さらに読む:Why use CHAPS?

さらに読む:What is the critical micelle concentration (CMC)?

さらに読む: What Bio-buffers and Bio-detergents are suitable for the purification process of viral vectors?

遺伝子治療の概念は単純に見えますが、実行するのは簡単ではありません。 さまざまな疾患や遺伝子に直面して、さまざまな「カスタマイズされた」設計も必要です。 研究開発には克服しなければならない多くの困難があります遺伝子治療薬の開発は、各遺伝子治療薬の背後にある高い研究開発コストをもたらします。 多くの学者は、この病気に苦しむ人々に利益をもたらすために、遺伝子治療のブレークスルーを達成するために一生を捧げてきました.

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Reference:

^[1] 一种快速高效分离和纯化重组腺病毒相关病毒的方法和用途: https://patents.google.com/patent/CN1139656C/zh

^[2] Proton NMR based investigation of the effects of temperature and NaCl on micellar properties of CHAPS: https://www.semanticscholar.org/paper/Proton-NMR-based-investigation-of-the-effects-of-on-Qin-Liu/29678d6ce3b6437498748054e51c4b4a920249af

^[3] AAV Purification by Iodixanol Gradient Ultracentrifugation: https://www.addgene.org/protocols/aav-purification-iodixanol-gradient-ultracentrifugation/#:~:text=In%20research%2C%20iodixanol%20is%20used,organelles%2C%20lipoproteins%2C%20and%20macromolecules.&text=The%20iodixanol%20gradient%20in%20this,from%20an%20impure%20AAV%20preparation.

^[4] Removal of Endotoxin from rAAV Samples Using a Simple Detergent-Based Protocol : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6804492/

^[5] Effective and Accurate Gene Silencing by a Recombinant AAV-Compatible MicroRNA Scaffold: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31843447/

^[6] Streamlined large-scale production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11883083/

^[7] Proton NMR based investigation of the effects of temperature and NaCl on micellar properties of CHAPS: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21322620/

^[8] Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications: https://www.nature.com/articles/s41598-019-49624-w

^[9] 藉Recent advances in recombinant adeno-associated virus vector production: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0085253815482031

^[10] Downstream Manufacturing of Gene Therapy Vectors: https://downstreamcolumn.com/downstream-manufacturing-gene-therapy-vectors/