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2023.02.04

ニッカーゼの生物学的作用機序とBufferの関係

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ニッカーゼの生物学的作用機序とBufferの関係

文: 黃俊淵 / 聚和國際 R&D 實習生
攝影師：RF._.studio: https://www.pexels.com/zh-tw/photo/3825572/

CRISPR (Clustered regular interspaced short palindromic repeats) は、同じ長さのスペーサー配列を持つ DNA 断片の小さな反復であり、細菌の免疫系の一部です。一部の細菌がウイルスに感染して生き残ると、CRISPR を使用して、感染したウイルス DNA を記憶し、ウイルスが細菌 DNA に組み込まれる前にウイルスを認識して破壊することができます。

この機能は、DNA および RNA 編集技術 (2 番目の段落で説明) で広く使用されており、酵素を使用した以前の遺伝子編集技術 (ZFN、TALEN) と比較して、CRISPR は非常に高速であり、近年のバイオテクノロジーの重要な焦点となっています。

CRISPR の特徴:

CRISPR 技術は、CRISPR/Cas9 や CRISPR/Cpf1 などのさまざまなニッカーゼにちなんで命名され、3 つの異なるタイプの CRISPR/Cas システムが発見されました。そのうちのタイプ II は、Cas9 とガイド RNA に依存して複合体を形成し、動作します (図 1)。 [1]。

(図 1) ガイド RNA (crRNA と tracerRNA または sgRNA で構成される) と Cas9 で構成される CRISPR/Cas9 認識複合体 [1]。

まず、ガイドRNA（crRNA tracerRNA）のプロトスペーサー配列からターゲットDNA配列を特定し、ターゲットが一致した後、Cas9はターゲットDNAのプロトスペーサーの直後の3つのアミノ酸（NGG）を切り取ります。プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) のストランド DNA。配列、そして細胞内の元の修復を介して、細胞内の元の修復メカニズムによってDNA修復が行われます（図2）。

（図2）CRISPRの運用プロセス

ニッカーゼの種類は、対応するバッファーと共に使用されます。

RNA のハイブリダイゼーション、フォールディング、および酵素相互作用を制御するために、RNA と NAI-N3 (アジド置換アシル化剤) によってポリアミド RNA が生成され、相補的な核酸とのハイブリダイゼーションが防止されます。このステップはマスキングと呼ばれます。 RNA のフォールディングと活性を回復するには、アシル基を自発的に除去できるアジドのシュタウディンガー還元を誘導する水溶性ホスフィンを使用します [2]。このステップはアンマスキングです。シュタウディンガー還元は、6.9 ～ 8.9 の pH 範囲で gRNA の活性を調整することができます [3]。生物学的緩衝液を使用するには、適切な溶解度、透過性 pKa、複合体形成がないこと、酵素との反応がないことなど、多くの条件を満たす必要があります。バッファー (すべての条件がリストされているわけではありません。[4][5] を参照してください)。ニッカーゼの種類や操作手順が異なれば、使用するバッファーも異なります。 CRISPR/Cas9 を例にとると、HEPES-KOH と HEPES は gRNA 転写精製とマスキングステップのバッファーとして使用され、その後のアンマスキングと DNA 切断では HEPES-KOH と HEPES をバッファーとして使用します。切断は、Tris-HCl および 1 × NEBufferTM3.1 バッファーで行いました [3]。

參考資料：

Redman, M. King, A. King, D. et al.. What is CRISPR/Cas9? Arch Dis Child Educ Pract Ed. 2016 Aug; 101(4): 213–215. doi: 10.1136/archdischild-2016-310459.
Kadina, A. Kietrys, A. Eric, T. RNA Cloaking by Reversible Acylation. Angew Chem Int Ed Engl. 2018 Mar; 57(12): 3059-3063. doi: 10.1002/anie.201708696.
Wang, R. Wu, Y. Zhou, X. et al.. Conditional control of RNA-guided nucleic acid cleavage and gene editing. Nature Communications 2020; 11(91). doi: 10.1038/s41467-019-13765-3.
Good, N. E. & Izawa, S. [3] Hydrogen ion buffers. Photosynthesis and Nitrogen Fixation Part B. Methods in Enzymology 1972; 24: 53–68. doi: 10.1016/0076-6879(72)24054-x.
Scopes, R. Verlag, S. Protein purification: Principles and practice, 3rd edition. FEBS Letters 1994 Oct; 352(3): 400-401. doi: 10.1016/0014-5793(94)80041-3.
Zhao, Z. Li, C. Tong, F. Deng, J. huang, G. Sang, Y. Review of applications of CRISPR-Cas9 gene-editing technology in cancer research. Biological Procedures Online 2021; 23(14). doi: 10.1186/s12575-021-00151-x