無菌培養法とは？

無菌培養とは、植物組織を無菌環境に閉じ込め、養液とともに培養する方法です。 通常、植物のカルスや切断された茎を使用して植物の遺伝子を複製し、成長して同じ遺伝子を持つ新しい植物になることができます。 そのため、in vitro 繁殖とも呼ばれます。 この種の栽培の特徴は、優れた遺伝子を持つ植物組織を選択して、優れた植物を栽培できることです。 そして、植物の根が養分に直接触れるため、土栽培よりも生育速度が早い！ 植物学では、絶滅寸前の植物を無菌培養で再生させる事例もある[3]。

無菌培養の操作方法

ステップ 1. 植物組織培養

植物の根、茎、葉など、治癒組織を自己修復する能力を持つものを使用し、それらを植物培養培地に接種し、細胞培養を使用して新しい芽を成長させます [4]。 培地の種類に応じて、固体寒天ゲル培地と液体懸濁培地に分けることができます。

ステップ 2. root 化文化

新しい芽が出た後。 植物の健康な根の発達を促進するために、発根培地に移植することができます。 同じ方法で植物の茎を切ることもできます。

Step3. 家畜化と栽培[5]

根を張った健康な植物は無菌培養容器から外に移され、ロックウール、スポンジ、砂利などの不活性培地に植えられ、大気環境に順応して生育を続けます。

参考文献: Soilless culture system and precautions

研究によると、植物培養培地の選択が発芽率に大きな影響を与えることが示されています。 栽培プロセス中、植物の組織と根の成長と代謝によっても、培地の pH 値が変化する場合があります。 培地のpH値は、植物の成長にとって非常に重要です。 pH 値の変化は、植物の成長を遅らせたり、枯死させたりする可能性があります。 したがって、生物学的緩衝液を使用することで、培地のpHを調整および維持できます。 以下は、植物組織培養培地で使用される一般的な生物学的緩衝液のリストです。

MES

基本情報：

• CAS No.: 4432-31-9
• 有用なpH範囲: 5.5 – 6.7

MESの適用:

• MES Buffer Affects Affects Araidopsis Root Apex Zonation and Root Growth by Suppressing Superoxide Generation in Root Apex研究の結果によると、0.01%および0.1%のMESが実生の初期発生段階から根の成長を促進することを示していますが、1%のMESは阻害されました。 [1]
• いくつかの研究では、1〜2 mMのMES溶液が優れた緩衝能力を持ち、ダイズの水耕栽培において根粒形成の阻害や窒素固定の低下を示さないことが明らかになりました. [1]
• この研究では、5 mM の MES はほとんどの栄養素の成長や摂取に影響を与えないことが示されています.[1]
• この研究では、結節のない大豆の実生においても、MES 緩衝液によってカリウムの取り込みが促進されることが示されています[1]。
• 白菜の小胞子培養に対する pH、MES、アラビノガラクタンタンパク質の影響に関する研究では、pH 6.4 の NLN-13 中の 10 mg l−1 アラビアゴムと 3 mM MES の組み合わせにより、小胞子の胚形成効率が大幅に向上しました。[2 ]
• NH4 が供給された植物に MES を供給すると、植物の収量が大幅に増加し、すべての濃度で根粒数が減少しました[9]。
• リンゴのマイクロシュートの茎からのカットの発根に対するpHの影響の研究。 MES を緩衝剤として使用した場合、pH は 5.0 ～ 6.5 に設定すると安定しました [10]。
• MES とプロリンで強化された培地は、イネの懸濁培養の成長中の細胞増殖に大きな影響を与えました [11]。
• 培地には、各 PVP、カゼイン加水分解物、および MES バッファーが 500 mg l−1 追加され、多量のカルスが含まれていることが観察されました。
• 一年生のメディカゴ種を用いた初期結節研究における MES 緩衝液の使用に関する研究では、0.5mM の MES 溶液は、毎日の滴定と溶液中の高い硝酸塩対アンモニウム比 (9:1) の使用によって pH を安定させることができます。 [12]
• これはカンナビス・サティバの光合成独立栄養マイクロプロパゲーションに使用され、その結果、5 mM MES バッファーを含む肥料溶液 1 容器あたり 300 mL が培地の pH を安定させ、発根の成功率を高めることが示されました[13]。

HEPES

基本情報：

• CAS No.: 4432-31-9
• 有用なpH範囲: 6.8 – 8.2

HEPES の適用:

• 静置培養水耕栽培による菌根菌株の生産において、HEPESは培養液のpH値を維持するために使用されます[8]。

PIPES

基本情報：

• CAS No.: 5625-37-6
• 有用なpH範囲: 6.1 – 7.5

PIPESの適用:

• 静置培養水耕栽培による菌根菌株の生産において、PIPESは培養液のpH値を維持するために使用されます[8]。

MOPS

基本情報：

• CAS No.: 1132-61-2
• 有用なpH範囲: 6.5 – 7.9

MOPS の適用:

• 水耕栽培システム研究の最適化にch、MOPSバッファーは、ポンガミアピンナタの根の固定液として使用されました。 セグメントを切断するために組織を柔らかくする能力があります.[7]
• 水耕栽培システム研究の最適化では、MOPS バッファーをインキュベーションバッファーとして使用し、ポンガミアピンナタの根の洗浄バッファーとして使用しました。 [7]
• NH4 の栄養研究では、pH が大幅に低下するため、pK が 6.5 ～ 7.5 の緩衝液を使用することが望ましいです。 ADA と ACES の悪影響のため、BES と MOPS が最も好まれる代替手段です [9]。

MES バッファーは、農業バイオ テクノロジーで広く使用されています。 バッファの選択に注意することが重要です。 リン酸緩衝液を選択すると、植物はリン酸を吸収します。 塩素を含む緩衝液を選択する場合、高濃度の塩素は植物にとって有毒である可能性があります.[6]

参考資料: MES Buffer used in HEMP

Reference:

^[1] MES Buffer Affects Arabidopsis Root Apex Zonation and Root Growth by Suppressing Superoxide Generation in Root Apex https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2016.00079/full

^[2] Yuan, Sx., Su, Yb., Liu, Ym. et al. Effects of pH, MES, arabinogalactan-proteins on microspore cultures in white cabbage. Plant Cell Tiss Organ Cult 110, 69–76 (2012). https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-012-0131-z

^[3] An effective nutrient medium for asymbiotic seed germination and large-scale in vitro regeneration of Dendrobium hookerianum, a threatened orchid of northeast India https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3260561/

^[4] Morphogenic processes in callus tissue cultures and de novo regeneration of plants in Actinidia chinensis Planch https://pbsociety.org.pl/journals/index.php/asbp/article/view/833

^[5] Purohit, S., Rawat, J.M., Pathak, V.K. et al. A hydroponic-based efficient hardening protocol for in vitro raised commercial kiwifruit (Actinidia deliciosa). In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant (2020). https://doi.org/10.1007/s11627-020-10127-3

^[6] How to maintain Hoagland Nutrient Solution(normally the pH is 5.6) at pH 3.0, 7.0 and 11.0 https://www.researchgate.net/post/How_to_maintain_Hoagland_Nutrient_Solutionnormally_the_pH_is_56_at_pH_30_70_and_110

^[7] Optimization of hydroponic growth system and Na+-fluorescence measurements for tree species Pongamia pinnata (L.) pierre https://doi.org/10.1016/j.mex.2020.100809

^[8] Production of mycorrhizal inoculum by static culture hydroponics https://patents.google.com/patent/WO1991001082A1/en

^[9] Nutrient Solution pH Control using Dipolar Buffers in Studies of Trifolium repens L. Nitrogen Nutrition https://www.researchgate.net/publication/240590018_Nutrient_Solution_pH_Control_using_Dipolar_Buffers_in_Studies_of_Trifolium_repens_L_Nitrogen_Nutrition

^[10] Effect of medium-pH and MES on adventitious root formation from stem disks of apple December 2008Plant Cell Tissue and Organ Culture 95(3):285-292 DOI: 10.1007/s11240-008-9442-5

^[11] Plant regeneration from cell suspension culture in Saccharum officinarum L. and ascertaining of genetic fidelity through RAPD and ISSR markers. https://link.springer.com/article/10.1007/s13205-016-0579-3

^[12] Ewing, M.A., Robson, A.D. The use of MES buffer in early nodulation studies with annual Medicago species. Plant Soil 131, 199–206 (1991). https://doi.org/10.1007/BF00009449

^[13] Cannabis sativa L. photoautotrophic micropropagation: a powerful tool for industrial scale in vitro propagation https://www.x-mol.com/paper/jourmal