利用HEPES提升蛋白質在哺乳動物細胞中的轉染效率

在現代生物技術中，蛋白質轉染技術在研究和治療中扮演著重要角色。然而，實現高效的蛋白質轉染一直是一項挑戰。2019年首次證明HEPES可以應用於各種分子量蛋白質（如抗體、重組蛋白、短胜肽）的轉染，這為蛋白質轉染技術帶來了新突破。

HEPES在蛋白質轉染中的應用

HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）是一種常用的緩衝劑，最新研究表明它能顯著提高蛋白質在哺乳動物細胞中的轉染效率。研究團隊成功地將STIP1抗體轉染至癌細胞中，並使STIP1蛋白降解，這證實了HEPES的有效性。這一現象的推測機制是HEPES能中和蛋白質的電荷，降低其擴散係數，使其更容易被細胞通過胞吞作用內化。

1. 機制
   HEPES能中和蛋白質的電荷，降低其擴散係數，使蛋白質更容易被細胞通過胞吞作用內化。這一特性使HEPES成為提高蛋白質轉染效率的理想選擇。
2. 實驗結果
   • STIP1抗體轉染：研究將STIP1抗體成功轉染至癌細胞中，並使STIP1蛋白降解，證實了HEPES的應用效果。
   • 最佳濃度：實驗表明，20mM的HEPES濃度是最佳選擇，即使濃度增加到50mM也無法提高轉染效率。
   • 培養基選擇：在測試的四種培養基中，只有Opti-MEM適用於HEPES蛋白質轉染。
   • Alexa Fluor 488抗體測試：在MDAH2774細胞中，HEPES成功轉染Alexa Fluor 488抗體，而Tris-HCl則未能成功。
3. 影響HEPES蛋白質轉染效率的參數包括：
   • 濃度：20mM是最佳濃度。
   • 培養基種類：Opti-MEM被證明是唯一適用的培養基。
   • 混合體積質量比：需精確控制以達到最佳轉染效果。
   • 孕育時間：需要根據具體實驗條件進行調整。

實驗驗證

1. Alexa Fluor 488抗體轉染測試
   Alexa Fluor 488標記的抗體作為模型蛋白，進行轉染測試。這種抗體具有較強的熒光信號，便於觀察和量化細胞內的轉染效率。實驗設計包括以下步驟：
   • 準備轉染溶液：分別使用HEPES和Tris-HCl兩種緩衝劑製備轉染溶液。兩組溶液中均含有Alexa Fluor 488標記的抗體，濃度一致。
   • 細胞培養：將MDAH2774卵巢癌細胞株培養至約80%的融合度。這種細胞株具有較高的增殖速率，適合作為轉染模型。
   • 轉染處理：將兩組轉染溶液分別加入細胞培養皿中，並孵育一定時間，讓細胞充分吸收轉染試劑。
   • 清洗和固定：孵育結束後，使用PBS溶液多次清洗細胞，去除未內化的抗體，隨後使用固定劑固定細胞。
   • 熒光顯微鏡觀察：使用熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光信號，並拍攝圖片進行分析。
     
     實驗結果顯示，使用HEPES轉染的細胞中出現了明顯的熒光信號，表明抗體成功內化。而使用Tris-HCl的對照組中，細胞內基本沒有觀察到熒光信號，這表明HEPES在蛋白質轉染中具有顯著的優勢。
2. 濃度效應測試
   為了確定最佳的HEPES濃度，研究團隊進一步設計了一組實驗，測試不同濃度下HEPES的轉染效率。實驗設計包括：
   • 濃度梯度：準備含有不同濃度HEPES的轉染溶液，濃度範圍從10mM到50mM不等。
   • 轉染和觀察：按照上述轉染步驟，將不同濃度的HEPES溶液分別加入細胞培養皿中，進行轉染處理，並使用熒光顯微鏡觀察轉染效果。
   • 結果顯示：在20mM濃度下，HEPES的轉染效率最高。當濃度提高到50mM時，轉染效率並未顯著增加，這表明20mM是HEPES的最佳工作濃度。
3. 培養基測試
   為了評估不同培養基對HEPES轉染效果的影響，研究團隊選用了四種常用培養基進行測試，分別是alpha-MEM、DMEM-F12、RPMI 1640和Opti-MEM。實驗步驟如下：
   • 細胞培養：分別在四種不同的培養基中培養MDAH2774細胞，直至達到80%的融合度。
   • 轉染處理：將20mM HEPES轉染溶液分別加入四組細胞中，進行轉染處理。
   • 熒光觀察：使用熒光顯微鏡觀察轉染效果，並比較不同培養基條件下的轉染效率。
   • 實驗結果：只有在Opti-MEM培養基中，HEPES轉染取得了最佳效果，其他三種培養基中的轉染效率較低。這表明Opti-MEM是適合HEPES蛋白質轉染的最佳培養基。
4. 綜合評估
   綜合上述實驗結果，可以得出結論：HEPES在蛋白質轉染中具有顯著的優勢，其最佳工作濃度為20mM，且Opti-MEM是最適合的培養基。這些發現為HEPES在蛋白質轉染技術中的應用提供了堅實的實驗基礎和理論支持，為未來的研究和應用開辟了新的方向。

市場應用和優勢

1. 低細胞毒性
   HEPES具有低細胞毒性，這使其在蛋白質轉染中的應用更加安全可靠。實驗結果顯示，即使在高達50mM的濃度下，HEPES對細胞的活力和毒性沒有明顯影響。這一特性對於長時間和高頻率的轉染實驗尤為重要。使用HEPES作為轉染試劑，可以減少對細胞生理狀態的干擾，保證細胞在轉染後依然保持良好的活力和功能，這為後續的生物學研究和應用提供了穩定的基礎。
2. 多種培養基的兼容性
   HEPES在多種培養基中均能有效發揮作用，這使其在不同實驗條件下具有廣泛的適應性。研究表明，HEPES可添加至alpha-MEM、DMEM-F12、RPMI 1640和Opti-MEM等常用於蛋白質轉染的培養基中。這種多樣化的兼容性使得研究者能夠根據實驗需求靈活選擇合適的培養基，從而優化轉染效果。特別是Opti-MEM，已被證實是HEPES蛋白質轉染的最佳選擇，進一步提升了HEPES在蛋白質轉染技術中的應用價值。
3. 獨特的電荷中和作用
4. HEPES具有獨特的電荷中和作用，這使其在蛋白質轉染中能夠有效降低蛋白質的擴散係數。HEPES能與蛋白質進行電荷中和，使蛋白質更加穩定並易於被細胞內化。這一特性是其他緩衝劑如Tris-HCl無法達到的。HEPES通過中和蛋白質的電荷，促進蛋白質在細胞膜上的吸附和胞吞，從而提高轉染效率。這種機制為HEPES在蛋白質轉染中的應用提供了科學依據，證明了其在增強蛋白質內化過程中的重要作用。
5. 多功能應用
6. HEPES除了在蛋白質轉染中的應用外，還常用於HEPES-buffered saline (HeBS) 磷酸鈣轉染技術中，該技術主要應用於DNA轉染。磷酸鈣轉染技術是一種經典且廣泛使用的基因轉染方法，而HEPES作為緩衝劑能夠穩定溶液的pH值，提高轉染效率。這表明HEPES在分子生物學實驗中的多功能性，既能用於蛋白質轉染，又能應用於DNA轉染，擴展了其在生物技術領域的應用範圍。
7. 新型轉染方式
   HEPES-protein mixture作為2019年提出的新型轉染方式，為蛋白質轉染提供了新的可能性和話題。這種方法已經申請專利，表明其在技術上的創新性和專有性。相比傳統的蛋白質轉染技術，如脂質體轉染、電穿孔轉染、病毒載體轉染和短胜肽轉染，HEPES-protein mixture具有獨特的優勢。它能夠在保持低毒性的同時，顯著提高轉染效率，為蛋白質轉染技術帶來了新的突破。這一創新技術的推出，不僅為研究者提供了新的工具，也為蛋白質轉染技術的市場應用開辟了新的前景

總結

HEPES在蛋白質轉染中的應用展示了其獨特的優勢，包括低細胞毒性、多種培養基的兼容性、獨特的電荷中和作用、多功能應用和新型轉染方式。這些優勢使得HEPES成為蛋白質轉染技術中的重要工具，具有廣泛的應用潛力和市場價值。隨著更多研究的深入和技術的發展，HEPES有望在生物技術領域中發揮越來越重要的作用，推動科學研究和應用的進一步發展。