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將功能性蛋白質有效轉染至細胞，為一種調節細胞常見的手段，能夠探索蛋白質與蛋白質相互作用與細胞內蛋白質運輸的信息。

 

常見的蛋白質轉染法分為兩種 - 化學性與物理性：

l 化學轉染法：利用載體攜帶蛋白質進入細胞。

l 物理性的電穿孔法：為暫時性在細胞膜上穿孔，讓蛋白質進入細胞中。

 

除了以上兩種方式，本文提出以HEPES進行蛋白質轉染 (如圖一)，其轉染效率在實驗卵巢癌細胞(MDAH 2774)上，不遜於市售轉染試劑(如PULSin、ProteoJuice、Pro-Ject、Xfect、BioPORTER QuickEase)，而且HEPES轉染法 (< 50 mM HEPES) 並沒有顯著地影響細胞存活率 (cell viability) 和細胞毒性(cytotoxicity)。

 

相較於市售轉染試劑價格普遍高昂，HEPES轉染法具有成本優勢，而此項技術已長久用於各式細胞培養基，其安全性與穩定性皆無疑慮。

圖一、使用HEPES轉染蛋白質流程圖 (來自文獻)

 

 

HEPES轉染條件

 

不同種類的蛋白質樣品與細胞，所需的HEPES濃度與混合時間都有所不同，需透過實驗調整成最佳化的HEPES轉染法。

 

建議採用的初始條件：取1mg蛋白質樣品與50ml的20mM HEPES 溶液混合 15 分鐘，再進行細胞培養與蛋白質轉染。此外細胞培養採用Opti-MEM (減血清培養基)與HEPES轉染法有最佳化效果。

 

 

HEPES轉染法原理

 

可適用之蛋白質樣品多元，例如：

 

1. 抗體(Alexa Fluor 488 等)，分子量約為150 kDa
2. 重組蛋白質 (rhSTIP1)，分子量約為66 kDa
3. 胜肽 (FLAG-tagged-Rve peptide)，分子量小於5 kDa

 

透過不同樣品特性差異 (例如：結構、組成、分子量和電荷等)，探討HEPES如何轉染至蛋白質細胞。

透過細胞實驗，我們已知細胞可透過三種胞吞作用(endocytosis) 促進蛋白質轉染至細胞中：

 

1. 大分子物質 ( 200 ~ 500 nm ) 透過大胞飲作用 (macropinocytosis)和陷穴蛋白依賴性內吞作用 (caveolae-dependent endocytosis)
2. 小分子物質 ( < 200 nm )，則依靠網格蛋白依賴性內吞作用 (clathrin-dependent endocytosis)。

 

同樣的細胞實驗，使用另一種常用的Good’s buffer --TRIS-HCl並沒有發現轉染效果。NMR實驗進一步發現，HEPES溶液的擴散係數在添加重組蛋白後約降低25%，而HEPES 的兩性離子特性中和了蛋白質樣品的表面電荷是一佐證。

 

適用HEPES轉染法的細胞種類

 

1. 乳腺癌細胞 (MCF7)
2. 子宮頸癌細胞 (HeLa),
3. 結腸癌細胞 (HT-29)
4. 子宮內膜癌細胞(ARK2 、RL952)
5. 膠質母細胞瘤細胞(U87)
6. 肝細胞癌 (HepG2)
7. 肺腺癌細胞 (CL1-0)
8. 紅白血病細胞 (HEL)
9. 小鼠卵巢癌細胞 (MOSEC),
10. 鼻咽癌細胞(NPC-BM1)
11. 非霍奇金氏淋巴瘤 (Toledo)
12. 卵巢癌細胞(MDAH2774 and SKOV3),
13. 胰腺癌細胞 (BxPC3)
14. 腎細胞腺癌細胞 (786-O)
15. 肉瘤癌細胞 (SK-LMS-1)

 

 

本文摘自文獻：

Utilization of HEPES for enhancing protein transfection into mammalian cells (https://doi.org/10.1016/j.omtm.2018.12.005)

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