利用HEPES提升蛋白质在哺乳动物细胞中的转染效率

在现代生物技术中，蛋白质转染技术在研究和治疗中扮演着重要角色。然而，实现高效的蛋白质转染一直是一项挑战。 2019年首次证明HEPES可以应用于各种分子量蛋白质（如抗体、重组蛋白、短胜肽）的转染，这为蛋白质转染技术带来了新突破。

HEPES在蛋白质转染中的应用

HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）是一种常用的缓冲剂，最新研究表明它能显著提高蛋白质在哺乳动物细胞中的转染效率。研究团队成功地将STIP1抗体转染至癌细胞中，并使STIP1蛋白降解，这证实了HEPES的有效性。这一现象的推测机制是HEPES能中和蛋白质的电荷，降低其扩散系数，使其更容易被细胞通过胞吞作用内化。

1. 机制
   HEPES能中和蛋白质的电荷，降低其扩散系数，使蛋白质更容易被细胞通过胞吞作用内化。这一特性使HEPES成为提高蛋白质转染效率的理想选择。
2. 实验结果
   • STIP1抗体转染：研究将STIP1抗体成功转染至癌细胞中，并使STIP1蛋白降解，证实了HEPES的应用效果。
   • 最佳浓度：实验表明，20mM的HEPES浓度是最佳选择，即使浓度增加到50mM也无法提高转染效率。
   • 培养基选择：在测试的四种培养基中，只有Opti-MEM适用于HEPES蛋白质转染。
   • Alexa Fluor 488抗体测试：在MDAH2774细胞中，HEPES成功转染Alexa Fluor 488抗体，而Tris-HCl则未能成功。
3. 影响HEPES蛋白质转染效率的参数包括：
   • 浓度：20mM是最佳浓度。
   • 培养基种类：Opti-MEM被证明是唯一适用的培养基。
   • 混合体积质量比：需精确控制以达到最佳转染效果。
   • 孕育时间：需要根据具体实验条件进行调整。

实验验证

1. Alexa Fluor 488抗体转染测试
   Alexa Fluor 488标记的抗体作为模型蛋白，进行转染测试。这种抗体具有较强的荧光信号，便于观察和量化细胞内的转染效率。实验设计包括以下步骤：
   • 准备转染溶液：分别使用HEPES和Tris-HCl两种缓冲剂制备转染溶液。两组溶液中均含有Alexa Fluor 488标记的抗体，浓度一致。
   • 细胞培养：将MDAH2774卵巢癌细胞株培养至约80%的融合度。这种细胞株具有较高的增殖速率，适合作为转染模型。
   • 转染处理：将两组转染溶液分别加入细胞培养皿中，并孵育一定时间，让细胞充分吸收转染试剂。
   • 清洗和固定：孵育结束后，使用PBS溶液多次清洗细胞，去除未内化的抗体，随后使用固定剂固定细胞。
   • 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察细胞内的荧光信号，并拍摄图片进行分析。
     
     实验结果显示，使用HEPES转染的细胞中出现了明显的荧光信号，表明抗体成功内化。而使用Tris-HCl的对照组中，细胞内基本没有观察到荧光信号，这表明HEPES在蛋白质转染中具有显著的优势。
     
      
2. 浓度效应测试
   为了确定最佳的HEPES浓度，研究团队进一步设计了一组实验，测试不同浓度下HEPES的转染效率。实验设计包括：
   • 浓度梯度：准备含有不同浓度HEPES的转染溶液，浓度范围从10mM到50mM不等。
   • 转染和观察：按照上述转染步骤，将不同浓度的HEPES溶液分别加入细胞培养皿中，进行转染处理，并使用荧光显微镜观察转染效果。
   • 结果显示：在20mM浓度下，HEPES的转染效率最高。当浓度提高到50mM时，转染效率并未显著增加，这表明20mM是HEPES的最佳工作浓度。
3. 培养基测试
   为了评估不同培养基对HEPES转染效果的影响，研究团队选用了四种常用培养基进行测试，分别是alpha-MEM、DMEM-F12、RPMI 1640和Opti-MEM。实验步骤如下：
   • 细胞培养：分别在四种不同的培养基中培养MDAH2774细胞，直至达到80%的融合度。
   • 转染处理：将20mM HEPES转染溶液分别加入四组细胞中，进行转染处理。
   • 荧光观察：使用荧光显微镜观察转染效果，并比较不同培养基条件下的转染效率。
   • 实验结果：只有在Opti-MEM培养基中，HEPES转染取得了最佳效果，其他三种培养基中的转染效率较低。这表明Opti-MEM是适合HEPES蛋白质转染的最佳培养基。
4. 综合评估
   综合上述实验结果，可以得出结论：HEPES在蛋白质转染中具有显著的优势，其最佳工作浓度为20mM，且Opti-MEM是最适合的培养基。这些发现为HEPES在蛋白质转染技术中的应用提供了坚实的实验基础和理论支持，为未来的研究和应用开辟了新的方向。
   
    

市场应用和优势

1. 低细胞毒性
   HEPES具有低细胞毒性，这使其在蛋白质转染中的应用更加安全可靠。实验结果显示，即使在高达50mM的浓度下，HEPES对细胞的活力和毒性没有明显影响。这一特性对于长时间和高频率的转染实验尤为重要。使用HEPES作为转染试剂，可以减少对细胞生理状态的干扰，保证细胞在转染后依然保持良好的活力和功能，这为后续的生物学研究和应用提供了稳定的基础。
2. 多种培养基的兼容性
   HEPES在多种培养基中均能有效发挥作用，这使其在不同实验条件下具有广泛的适应性。研究表明，HEPES可添加至alpha-MEM、DMEM-F12、RPMI 1640和Opti-MEM等常用于蛋白质转染的培养基中。这种多样化的兼容性使得研究者能够根据实验需求灵活选择合适的培养基，从而优化转染效果。特别是Opti-MEM，已被证实是HEPES蛋白质转染的最佳选择，进一步提升了HEPES在蛋白质转染技术中的应用价值。
3. 独特的电荷中和作用
   HEPES具有独特的电荷中和作用，这使其在蛋白质转染中能够有效降低蛋白质的扩散系数。 HEPES能与蛋白质进行电荷中和，使蛋白质更加稳定并易于被细胞内化。这一特性是其他缓冲剂如Tris-HCl无法达到的。 HEPES通过中和蛋白质的电荷，促进蛋白质在细胞膜上的吸附和胞吞，从而提高转染效率。这种机制为HEPES在蛋白质转染中的应用提供了科学依据，证明了其在增强蛋白质内化过程中的重要作用。
4. 多功能应用
   HEPES除了在蛋白质转染中的应用外，还常用于HEPES-buffered saline (HeBS) 磷酸钙转染技术中，该技术主要应用于DNA转染。磷酸钙转染技术是一种经典且广泛使用的基因转染方法，而HEPES作为缓冲剂能够稳定溶液的pH值，提高转染效率。这表明HEPES在分子生物学实验中的多功能性，既能用于蛋白质转染，又能应用于DNA转染，扩展了其在生物技术领域的应用范围。
5. 新型转染方式
   HEPES-protein mixture作为2019年提出的新型转染方式，为蛋白质转染提供了新的可能性和话题。这种方法已经申请专利，表明其在技术上的创新性和专有性。相比传统的蛋白质转染技术，如脂质体转染、电穿孔转染、病毒载体转染和短胜肽转染，HEPES-protein mixture具有独特的优势。它能够在保持低毒性的同时，显著提高转染效率，为蛋白质转染技术带来了新的突破。这一创新技术的推出，不仅为研究者提供了新的工具，也为蛋白质转染技术的市场应用开辟了新的前景。
    

总结

HEPES在蛋白质转染中的应用展示了其独特的优势，包括低细胞毒性、多种培养基的兼容性、独特的电荷中和作用、多功能应用和新型转染方式。这些优势使得HEPES成为蛋白质转染技术中的重要工具，具有广泛的应用潜力和市场价值。随着更多研究的深入和技术的发展，HEPES有望在生物技术领域中发挥越来越重要的作用，推动科学研究和应用的进一步发展。